Ora del decesso: nuova tecnologia necessaria per una maggiore precisione

Per i ricercatori che studiano la neurodegenerazione, questa mancanza di una precisa dichiarazione del "tempo di morte" per i neuroni rende difficile definire quali fattori portano alla morte cellulare e selezionare i farmaci che potrebbero salvare le cellule invecchiate dalla morte.              

Ora, i ricercatori dei Gladstone Institutes hanno sviluppato una nuova tecnologia che consente loro di tracciare migliaia di cellule alla volta e determinare il momento preciso della morte per ogni cellula del gruppo. Il team ha dimostrato, in un articolo pubblicato sulla rivista Nature Communications, che l'approccio funziona nei roditori e nelle cellule umane, nonché all'interno del pesce zebra vivo, e può essere utilizzato per seguire le cellule per un periodo di settimane o mesi.

"Ottenere un momento preciso della morte è molto importante per svelare causa ed effetto nelle malattie neurodegenerative", afferma Steve Finkbeiner, MD, PhD, direttore del Center for Systems and Therapeutics di Gladstone e autore senior di entrambi i nuovi studi. "Ci consente di capire quali fattori stanno causando direttamente la morte cellulare, quali sono accidentali e quali potrebbero essere meccanismi di risposta che ritardano la morte".

In un articolo pubblicato sulla rivista Science Advances, i ricercatori hanno combinato la tecnologia dei sensori cellulari con un approccio di apprendimento automatico, insegnando a un computer come distinguere le cellule vive e morte 100 volte più velocemente e con maggiore precisione rispetto a un essere umano.

"Ci sono voluti mesi agli studenti universitari per analizzare manualmente questo tipo di dati e il nostro nuovo sistema è quasi istantaneo: in realtà funziona più velocemente di quanto possiamo acquisire nuove immagini al microscopio", afferma Jeremy Linsley, PhD, leader del programma scientifico nel Finkbeiner's lab e il primo autore di entrambi i nuovi articoli.

Insegnare nuovi trucchi a un vecchio sensore

Quando le cellule muoiono, qualunque sia la causa o il meccanismo, alla fine si frammentano e le loro membrane degenerano. Ma questo processo di degradazione richiede tempo, rendendo difficile per gli scienziati distinguere tra cellule che hanno smesso di funzionare da tempo, quelle malate e morenti e quelle sane.

I ricercatori in genere usano tag o coloranti fluorescenti per seguire le cellule malate con un microscopio nel tempo e cercare di diagnosticare dove si trovano all'interno di questo processo di degradazione. Sono stati sviluppati molti indicatori, coloranti ed etichette per distinguere le cellule già morte da quelle ancora vive, ma spesso funzionano solo per brevi periodi di tempo prima di sbiadire e possono anche essere tossici per le cellule quando vengono applicati.

"Volevamo davvero un indicatore che durasse per l'intera vita di una cellula, non solo per poche ore, e che fornisse un segnale chiaro solo dopo il momento specifico in cui la cellula muore", afferma Linsley.

Linsley, Finkbeiner e i loro colleghi hanno cooptato sensori di calcio, originariamente progettati per monitorare i livelli di calcio all'interno di una cellula. Quando una cellula muore e le sue membrane diventano permeabili, un effetto collaterale è che il calcio si precipita nel citosol acquoso della cellula, che normalmente ha livelli relativamente bassi di calcio.

Quindi, Linsley ha progettato i sensori di calcio per risiedere nel citosol, dove sarebbero diventati fluorescenti solo quando i livelli di calcio aumentavano a un livello che indicava la morte cellulare. I nuovi sensori, noti come indicatori di morte codificati geneticamente (GEDI, pronunciato come Jedi in Star Wars), potrebbero essere inseriti in qualsiasi tipo di cellula e segnalare che la cellula è viva o morta per l'intera vita della cellula.

Per testare l'utilità dei sensori riprogettati, il gruppo ha posto al microscopio grandi gruppi di neuroni, ciascuno contenente GEDI. Dopo aver visualizzato più di un milione di cellule, in alcuni casi soggette a neurodegenerazione e in altri esposte a composti tossici, i ricercatori hanno scoperto che il sensore GEDI era molto più accurato di altri indicatori di morte cellulare: non c'era un solo caso in cui il sensore era attivato e una cellula è rimasta in vita. Inoltre, oltre a tale accuratezza, GEDI sembrava anche rilevare la morte cellulare in una fase precedente rispetto ai metodi precedenti, vicino al "punto di non ritorno" per la morte cellulare.

"Questo consente di separare le cellule vive e morte in un modo che non è mai stato possibile prima", afferma Linsley.

Rilevamento di morte sovrumana

Linsley ha menzionato GEDI a suo fratello, Drew Linsley, PhD, un assistente professore alla Brown University specializzato nell'applicazione dell'intelligenza artificiale a dati biologici su larga scala. Suo fratello ha suggerito ai ricercatori di utilizzare il sensore, insieme a un approccio di apprendimento automatico, per insegnare a un sistema informatico a riconoscere le cellule cerebrali vive e morte basandosi solo sulla forma della cellula.

Il team ha accoppiato i risultati del nuovo sensore con dati di fluorescenza standard sugli stessi neuroni e ha insegnato a un modello computerizzato, chiamato BO-CNN, a riconoscere i tipici modelli di fluorescenza associati a come appaiono le cellule morenti. Il modello, hanno mostrato i fratelli Linsley, era accurato al 96% e migliore di quello che possono fare gli osservatori umani, ed era più di 100 volte più veloce dei precedenti metodi di differenziazione delle cellule vive e morte.

"Per alcuni tipi di cellule, è estremamente difficile per una persona capire se una cellula è viva o morta, ma il nostro modello al computer, imparando da GEDI, è stato in grado di differenziarle in base a parti delle immagini che non avevamo conosciuto in precedenza. sono stati utili per distinguere le cellule vive da quelle morte", afferma Jeremy Linsley.

Sia GEDI che BO-CNN consentiranno ora ai ricercatori di condurre nuovi studi ad alto rendimento per scoprire quando e dove muoiono le cellule cerebrali, un endpoint molto importante per alcune delle malattie più importanti. Possono anche esaminare i farmaci per la loro capacità di ritardare o evitare la morte cellulare nelle malattie neurodegenerative. Oppure, nel caso del cancro, possono cercare farmaci che accelerino la morte delle cellule malate.

"Queste tecnologie cambiano le regole del gioco nella nostra capacità di capire dove, quando e perché si verifica la morte nelle cellule", afferma Finkbeiner. “Per la prima volta, possiamo davvero sfruttare la velocità e la scala fornite dai progressi della microscopia assistita da robot per rilevare in modo più accurato la morte cellulare e farlo con largo anticipo rispetto al momento della morte. Speriamo che questo possa portare a terapie più specifiche per molte malattie neurodegenerative che finora sono state incurabili».