Analisi dei dati pubblici

I dati sui lignaggi SARS-CoV-2 e la data in cui il campione è stato prelevato dalle sequenze disponibili dal Cile sono stati ottenuti dal sito del Consorcio Genomas CoV2 disponibile all'indirizzo https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. I dati sulle vaccinazioni sono stati ottenuti da dati pubblici del Ministero della Scienza, Tecnologia, Conoscenza e Innovazione disponibili all'indirizzo https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (Prodotto 83).

Test di infettività

I virus pseudotipati che trasportano diverse proteine spike SARS-CoV-2 sono stati preparati come descritto in precedenza¹². In breve, gli pseudotipi SARS-CoV-1 basati su HIV-2 sono stati prodotti nelle cellule HEK293T trasfettando il pNL4.3-ΔEnv-Luc insieme al corrispondente vettore di codifica pCDNA-SARS-CoV-2 Spike in un rapporto molare 1:1. Plasmidi che codificano un picco ottimizzato per il codone privo degli ultimi 19 aminoacidi dell'estremità C-terminale (SΔ19) noti per evitare la ritenzione nel reticolo endoplasmatico¹² sono stati ottenuti mediante sintesi genetica o mutagenesi sito-diretta personalizzata (GeneScript) e contenevano le seguenti mutazioni: lignaggio A (sequenza di riferimento), lignaggio B (D614G), lignaggio B.1.1.7 (Δ69-70, Δ144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H), linea P.1 (L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I) e linea C.37 (G75V, T76I, Δ246 252- 452, L490Q, F614S, D859G, T3,000N). Ciascuna preparazione di pseudotipo è stata eliminata mediante centrifugazione a 1 giri/min a temperatura ambiente, quantificata utilizzando il kit ELISA HIV-24 Gag p50 Quantikine (R&D Systems), aliquotata in siero bovino fetale al 80% (Sigma-Aldrich) e conservata a -1 °C fino al utilizzo. Diverse quantità di virus pseudotipizzati (come determinato dai livelli della proteina p24 dell'HIV-2) sono state utilizzate per infettare le cellule HEK-ACE48 e 96 ore dopo, l'attività della luciferasi della lucciola è stata misurata utilizzando il reagente per il test della luciferasi (Promega) in una micropiastra Glomax XNUMX luminometro (Promega).

Saggio di neutralizzazione

I test di neutralizzazione del virus pseudotipato sono stati eseguiti essenzialmente come descritto in precedenza¹². In breve, diluizioni seriali dei campioni di plasma (da 1:4 a 1:8748) sono state preparate in DMEM con siero bovino fetale al 10% e incubate con 5 ng di p24 di ciascun virus pseudotipato per 1 ora a 37 °C e poi, 1×10⁴ di cellule HEK-ACE2 sono state aggiunte a ciascun pozzetto. Le cellule HEK293T (che non esprimono ACE2) incubate con il virus pseudotipato (lignaggio A) sono state utilizzate come controllo negativo. Le cellule sono state lisate 48 ore dopo e l'attività della luciferasi della lucciola è stata misurata utilizzando il reagente per il test della luciferasi (Promega) in un luminometro per micropiastre Glomax 96 (Promega). È stata calcolata la percentuale di neutralizzazione per ciascuna diluizione e l'ID50 di ciascun campione è stato calcolato utilizzando GraphPad Prism versione 9.0.1.

analisi statistiche

Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software GraphPad Prism versione 9.1.2. Sono stati effettuati confronti multipli tra gruppi per i titoli anticorpali neutralizzanti (NAbT) contro un pannello di virus pseudotipati SARS-CoV-2, nonché confronti delle risposte NAbs in base al sesso e allo stato di fumo, utilizzando un test con classificazione con segno di Wilcoxon accoppiato. La variazione del fattore è stata calcolata come differenza della media geometrica del titolo nell'ID₅₀ rispetto a quello del virus pseudotipato Wild type. L'analisi di correlazione tra NAbT ed età o BMI è stata effettuata utilizzando il test di Spearman. Sono stati eseguiti l'ANOVA unidirezionale e il test di confronto multiplo di Tukey per l'analisi statistica dell'infettività. Un valore p ≤0.05 è stato considerato statisticamente significativo.

Approvazione etica

Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico della Facoltà di Medicina dell'Università del Cile (Progetti N° 0361-2021 e N° 096-2020) e della Clínica Santa Maria (Progetto N° 132604-21). Tutti i donatori hanno firmato il consenso informato e i loro campioni sono stati resi anonimi.

Impatto delle mutazioni spike nella variante Lambda sull'infettività e sulle risposte degli anticorpi neutralizzanti

Un'analisi di 3695 sequenze provenienti dal Cile depositate presso GISAID il 24 giugno^th Il 2021 mostra una chiara predominanza delle varianti SARS-CoV-2 Gamma e Lambda durante l’ultimo trimestre che rappresentano, insieme, il 79% di tutte le sequenze.

È interessante notare che questo periodo è stato caratterizzato da una massiccia campagna di vaccinazione in cui il 65.6% della popolazione target (individui di 18 anni e più) ha ricevuto uno schema di vaccinazione completo secondo il 27 giugno.^th 2021

Dato che il 78.2% delle persone inoculate con uno schema completo ha ricevuto il vaccino con virus inattivato CoronaVac di Sinovac Biotech, abbiamo cercato di studiare l’impatto delle mutazioni del picco presenti nella variante Lambda sulla capacità neutralizzante degli anticorpi provocati da questo vaccino.

Per questo, abbiamo generato virus pseudotipizzati SARS-CoV-1 basati su HIV-2 che trasportano la proteina spike dal lignaggio di riferimento Wuhan-1 (tipo selvaggio; lignaggio A), la mutazione D614G (lignaggio B) e l'Alfa (lignaggio B .1.1.7), varianti Gamma (lignaggio P.1) e Lambda (lignaggio C.37).

Durante la preparazione del virus, abbiamo costantemente osservato che le cellule infettate dal virus pseudotipato portatore del picco Lambda producevano valori di bioluminescenza significativamente più elevati rispetto al mutante D614G o alle varianti Alpha e Gamma indicando una maggiore infettività guidata dalla proteina picco Lambda

Immagine 1.Infettività mediata da diverse proteine spike.

(A) Rappresentazione schematica della proteina spike SARS-CoV-2 e delle varianti utilizzate in questo studio. I lignaggi sono indicati tra parentesi. RBD, dominio di legame del recettore, CM; coda citoplasmatica.

(B) Titolazione degli pseudotipi di ciascun lignaggio utilizzando quantità equivalenti di HIV-1 p24. L'attività della luciferasi della lucciola è stata misurata come unità di luminescenza relativa (RLU) a 48 ore dopo l'infezione. La media e la DS sono state calcolate da un esperimento triplicato rappresentativo.

Successivamente, abbiamo utilizzato i virus pseudotipati menzionati sopra per eseguire test di neutralizzazione utilizzando 79 campioni di plasma di operatori sanitari sani dell’Università del Cile e della Clínica Santa María a Santiago, in Cile.

Abbiamo escluso 4 campioni poiché non siamo stati in grado di calcolare un titolo ID50. Dei campioni analizzati, il 73% corrispondeva a donne, età mediana 34 anni (IQR 29 – 43) e un indice massimo corporeo (BMI) di 25 (IQR 22.7 – 27). Il 20.5% dei partecipanti ha dichiarato di essere un fumatore attivo durante il periodo di immunizzazione. I campioni sono stati ottenuti in una media di 95 giorni (IQR 76 – 96) dopo la seconda dose del vaccino CoronaVac

Abbiamo osservato che la neutralizzazione del virus pseudotipato che trasportava la proteina spike di tipo Wild ha prodotto una diluizione inibitoria del 50% (ID₅₀) titolo medio di 191.46 (154.9 – 227.95, IC 95%,), mentre era 153.92 (115.68 – 192.16, IC 95%), 124.73 (86.2 – 163.2, IC 95%), 104.57 (75.02 – 134.11, IC 95%) ) e 78.75 (49.8 – 107.6, IC 95%) per i virus pseudotipizzati portatori della proteina spike del mutante D614G o delle varianti Alpha, Gamma e Lambda, rispettivamente.

Abbiamo anche osservato che la media geometrica del titolo dell'ID₅₀ i titoli sono diminuiti di un fattore di 3.05 (2.57 – 3.61, IC 95%) per il virus pseudotipato portatore del picco Lambda, 2.33 (1.95 – 2.80, IC 95%) per il picco Gamma, 2.03 (1.71 – 2.41, IC 95%) per il picco Alpha e 1.37 (1.20 – 1.55, IC 95%) per il picco D614G rispetto al picco di tipo Wild.

Nel nostro gruppo di studio non è stata osservata alcuna correlazione tra sesso, età, indice di massa corporea (BMI) o stato di fumo e titoli anticorpali neutralizzanti.

Immagine 2.Test di neutralizzazione utilizzando campioni di plasma di vaccinati CoronaVac

(A) Cambiamenti nel titolo di neutralizzazione reciproco al 50% (ID₅₀) nei campioni di plasma di 75 destinatari del vaccino CoronaVac contro D614G (lignaggio B), Alpha (lignaggio B.1.1.7),

Varianti Gamma (lignaggio P.1) e Lambda (lignaggio C.37) rispetto al virus di tipo selvaggio. I risultati vengono visualizzati come differenza nei titoli di neutralizzazione dei campioni abbinati. Valori P per il confronto dell'ID₅₀ sono calcolati con il test dei ranghi con segno di Wilcoxon.

(B) I box plot indicavano l'intervallo mediano e interquartile (IQR) dell'ID₅₀ per ogni virus pseudotipato. Le modifiche dei fattori vengono visualizzate come differenza della media geometrica del titolo nell'ID₅₀ rispetto a quelli del virus pseudotipato Wild type. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il test dei ranghi con segno di Wilcoxon per coppie abbinate.

Insieme, i nostri dati hanno rivelato che la proteina spike della variante di interesse recentemente riconosciuta Lambda, altamente circolante in Cile e nei paesi sudamericani, porta mutazioni che conferiscono maggiore infettività e capacità di sfuggire agli anticorpi neutralizzanti provocati da CoronaVac.